【支原體核酸法】用定量標準品

目前，支原體核酸檢測法（常規PCR、熒光定量PCR）應用較為廣泛，尤其在生物制藥和細胞治療領(lǐng)域，可以替代傳統的培養法和DNA染色法。但同時(shí)，各種品牌的支原體PCR和qPCR檢測試劑盒又良莠不齊，因此，對核酸法本身進(jìn)行方法學(xué)驗證是非常必要的。

上對支原體核酸法的驗證提出了三項要求：檢測限、特異性和耐用性。在檢測限方面，歐洲藥典除了規定要達到10CFU/ml或100CFU/ml外，也指出可以用等量的支原體核酸拷貝數來(lái)表示。這時(shí)就需要選用合適的支原體核酸標準品。

的微生物污染防控公司Minerva Biolabs（以下簡(jiǎn)稱(chēng)德國MB公司），專(zhuān)門(mén)提供包括歐洲/日本藥典9種支原體在內的PCR定量標準品共14種，可進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)苽錁藴是€(xiàn)，確定核酸法的檢測限，因而廣受藥廠(chǎng)的青睞。

德國MB公司提供的PCR定量標準品信息如下：

德國MB公司提供的PCR定量標準品信息如下：

一、試劑盒組分：

說(shuō)明：2-8℃保存。使用前，標準品溶解后在-18℃以下保存。避免反復凍融。

、質(zhì)控保證

微生物在液體培養基中培養，并在對數生長(cháng)期末期收集。DNA用酚氯f(wàn)ang抽提，繼而用過(guò)濾柱純化。DNA純度用分光光度計法測量，保證OD260/280≥1.8。微生物物種用Sanger測序法確定。

純化DNA的定量采用小牛胸腺DNA標準品進(jìn)行光密度測量，進(jìn)而用熒光法證實(shí)。DNA終稀釋?zhuān)⒄{整為1×10⁸基因組拷貝/管。稀釋倍數用qPCR分析證實(shí)。

每個(gè)批號的產(chǎn)品均提供質(zhì)控證明。

三、操作步驟：

1、標準品復溶

（1）所有管短時(shí)離心。

（2）加入100μl Tris緩沖液到帶綠蓋的管中。

（3）室溫靜置5分鐘。

（4）渦旋振蕩10秒，再離心5秒。

（5）使用適當體積的DNA溶液直接用于PCR或直接稀釋?zhuān)糜谥苽銬NA標準曲線(xiàn)

2、制備10倍稀釋的DNA標準曲線(xiàn)

（1）使標準品和Tris緩沖液室溫達到平衡。

（2）標記每個(gè)1.5ml離心管。每個(gè)管加入90ml Tris緩沖液。

（3）標準品混勻離心。

（4）標準品1：加10μl標準品母液到第1管，蓋蓋并混勻。簡(jiǎn)要離心。

（5）標準品2：從第1管中取出10μl到第2管，蓋蓋并混勻。簡(jiǎn)要離心。

（6）標準品3：從第2管中取出10μl到第3管，蓋蓋并混勻。簡(jiǎn)要離心。

（7）下面的管均重復以上步驟。推薦制備6個(gè)標準品（梯度稀釋?zhuān)?/span>

3、PCR擴增

溶解的DNA可直接用于常規PCR。德國MB公司推薦Venor®GeM PCR試劑盒用于支原體檢測，或Onar®

Bacteria PCR試劑盒用于細胞培養中的細菌檢測。

對于qPCR，使用梯度稀釋的DNA標準品，可制備標準曲線(xiàn)。大多數qPCR軟件允許通過(guò)標準曲線(xiàn)進(jìn)行定量分析。這依賴(lài)于正確的設置，包括標準曲線(xiàn)的參數。為便于正確定量，要確定你的標準曲線(xiàn)樣品。使用者可以試用下列參數用于設置。體積決定了每個(gè)PCR反應的基因組拷貝數。

4、評估

使用梯度稀釋?zhuān)琿PCR檢測后Ct值會(huì )隨著(zhù)DNA濃度下降而升高。通過(guò)Ct值和DNA樣本量產(chǎn)生一條標準曲線(xiàn)，未知樣本的濃度通過(guò)標準曲線(xiàn)可以計算。下列的擴增曲線(xiàn)是用德國MB公司的Venor®

GeM qEP試劑盒繪制的。所用儀器為CFX96 Touch熒光定量PCR儀。

圖1. 梯度稀釋標準品的擴增曲線(xiàn)。標準品為發(fā)酵支原體的10⁶至10個(gè)基因組拷貝數。

圖2.用Bio-Rad CFX Manager軟件產(chǎn)生的標準曲線(xiàn)。

總之，PCR定量標準品可提供低拷貝數的DNA標準品，因而可精zhun確定核酸法的檢測限。而10CFU的靈敏度標準品只能觀(guān)察是否能達到這一閾值，而無(wú)法確定終為多少。從這個(gè)角度說(shuō)，PCR定量標準品具有自己*的優(yōu)勢。